Metodo per l’identificazione degli stati conformazionali delle proteine mediante spettroscopia UV- Visibile e microscopia in fluorescenza (pro-Morphos)

Le proteine possono esistere in differenti stati conformazionali e la variazione di tali stati può determinare un drastico cambiamento nella funzionalità di queste molecole. Non è semplice riuscire a determinare questi cambiamenti e vi è spesso la necessità di ricorrere a diversi metodi di determinazione (quali cromatografia per gel filtrazione, fluorescenza, ultracentrifugazione, light scattering, PAGE, dialisi, misure di torbidità) e a differenti tipi di sonde colorate. Le tecniche su menzionate hanno lo svantaggio di richiedere spesso tempi abbastanza lunghi, sono tecniche costose che richiedono strumentazione sofisticata e personale adeguatamente formato per poterle eseguire. Inoltre non si adattano a qualunque tipo di proteina che viene presa in considerazione, anzi è spesso necessario cambiare tecnica a seconda delle proprietà delle proteine che vengono prese in esame. Può anche capitare che le condizioni necessarie per utilizzare queste tecniche possano modificare i componenti che vogliamo analizzare e, di conseguenza le conformazioni delle proteine stesse, con dei falsi positivi che non si riferiscono ai processi analizzati. La sonda, oggetto della presente proposta di brevetto, offre, mediante metodiche semplici e altamente ripetibili, la possibilità di analizzare variazioni nella conformazione e nella struttura delle proteine, permettendo di capire se esse si trovino nello stato nativo, denaturato o aggregato. Inoltre essa può essere utilizzata con strumenti di analisi semplici e di ampia diffusione nei laboratori (quali spettrofotometri, fluorimetri, microscopi). Si tratta di una molecola sintetizzata chimicamente in laboratorio, che possiede dei gruppi che ne permettono l’utilizzo sia in spettroscopia UV-visibile sia mediante tecniche di fluorescenza, basata su un derivato del Bodipy (8-(4-iodofenil)-1,7-dimetil-3,5-bis-[(1E)-2-[4-[(S)-(2-succinil)amminocarbonilfenil]etenil]-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene). La sintesi di questa molecola è stata già pubblicata, così come il suo utilizzo quale sonsore per il rame, ma nulla è riportato in letteratura circa la sua interazione con le proteine. Queste potenzialità e versatilità sono di grande interesse sia da un punto di vista diagnostico che produttivo-industriale. Infatti molte proteine che vengono prodotte mediante ingegnerizzazione dei microorganismi spesso presentano problemi di stabilità e tendono ad aggregare e perdere la loro funzione, portando alla purificazione e distribuzione di componenti non più funzionali o con parziale funzionalità e dall’inevitabile ricaduta commerciale negativa. Altrettanto importante è il discorso in ambito diagnostico dove la presenza di proteine in stati conformazionali differenti da quello nativo permette di identificare markers altamente efficienti dell’insorgenza di patologie e di cattivo funzionamento a livello di organi e tessuti. La sonda, oggetto della presente proposta di brevetto, è caratterizzata da tre bande di assorbimento (350, 587 e 634 nm), in spettroscopia UV-visibile, nette e ben distinte, alcune delle quali si modificano in maniera significativa in seguito all’interazione con le proteine (Allegato 1). La bande a 350 e 587 nm sono particolarmente utili per l’interazione con le proteine nello stato nativo, presentando delle variazioni che sono direttamente correlate con la concentrazione delle proteine in esame ed evidenziabili dalla netta diminuzione del massimo di assorbimento delle bande della sonda in spettroscopia UV-visibile (Allegato 1). Anche la banda a 634 nm subisce una diminuzione nel massimo di assorbimento, ma meno marcata delle altre due (Allegato 1). Inoltre la correlazione lineare tra incremento della concentrazione proteica e variazione dell’assorbanza a 587 nm permette di utilizzare la sonda come metodo di quantificazione delle proteine nell’intervallo di concentrazione 0-24 g/ml (Allegato 1, inserto) anche grazie alla sua efficienza in un ampio range di pH (6-10) e con diversi tamponi utilizzati in ambito biologico e industriale. La grande versatilità della sonda permette anche, sempre mediante spettroscopia UV-visibile, di evidenziare facilmente la presenza di proteine aggregate, rispetto a quelle native, perché in questo caso si ha uno spostamento delle tre bande di assorbimento verso lunghezza d’onda maggiori, e questo spostamento è tanto più marcato quanto più il processo evolve (Allegato 2). In questo caso focalizzando la nostra attenzione sulla banda a 634 nm è possibile notare che quando le proteine si trovano tutte nello stato aggregato e fibrillato si ha un netto spostamento della banda di circa 8 nm senza diminuzione dell’intensità della banda (Allegato 2). Nel caso di processi di denaturazione, invece, si ha un piccolo spostamento delle bande e una diminuzione della loro intensità. La sonda ha una doppia funzionalità e praticità, perché oltre ad essere utilizzabile mediante spettroscopia UV-visibile è anche in grado di evidenziare aggregati proteici mediante microscopia in fluorescenza. Questi aggregati sono evidenziabili sia in proteine purificate e sottoposte a processo di aggregazione, sia in vetrini istologici in cui siano presenti aggregati di tipo amiloideo (Allegato 3 e 4). La formazione di aggregati proteici risulta chiaramente evidenziabile da una netta e marcata fluorescenza rossa degli aggregati in microscopia in fluorescenza con risultati in tutto e per tutto sovrapponibili a quelli ottenuti con tioflavina T (sonda presente in commercio e utilizzata per scopo, ma con un aumento di quella che è la definizione delle strutture aggregate ed una maggiore sensibilità (Allegato 3 e 4). La colorazione e la presenza di aggregati amiloidei sono ben evidenti anche in sezioni di tessuti fissati ottenuti da soggetti che soffrono di patologie amiloidee, anche in questo caso si osserva la formazione di strutture intensamente colorate di rosso che risaltano sul resto del tessuto (Allegato 4). In confronto con le sonde più comunemente utilizzate (la tioflavina T e il Congo Red), che possono essere utilizzate o in spettroscopia UV-visibile o in microscopia in fluorescenza, la sonda oggetto del brevetto è in grado di essere utilizzata in entrambe le tecniche, completando e rafforzando il dato, potendo fornire sia misure qualitative che quantitative e potendo analizzare differenti tipi di aggregati sia in soluzione che dentro preparati istologici. Il differente spostamento che si verifica nella spettroscopia UV-visibile permette anche di determinare se si tratti di processi di aggregazione o di denaturazione. Questi due processi non sono facilmente distinguibili con le altre sonde. Inoltre mostra un incremento della luminosità e della definizione delle fibrille in fluorescenza, rispetto alla colorazione attualmente utilizzata con la tioflavina T.