I difetti congeniti del cervelletto e del tronco encefalo (“Cerebellar and Brainstem Congenital Defects” - CBCD) sono patologie eterogenee caratterizzate da un’elevata variabilità fenotipica. In associazione ai segni tipici del coinvolgimento cerebellare, quali ipotonia atassia e nistagmo, i pazienti con CBCD spesso presentano ritardo mentale, alterazioni del comportamento (come autismo e tratti autistici) e variabile coinvolgimento multiorgano (Barkovich et al., 2009; Doherty et al, 2013). L’incidenza delle varie forme di CBCD può essere stimata in circa 1 su 3000/4000 nati. Nella maggior parte dei casi la diagnosi può essere effettuata anche in epoca prenatale, mediante ecografia a partire dal secondo trimestre di gestazione, e la rilevazione di tali difetti rappresenta una delle più comuni cause di interruzione volontaria di gravidanza. Sono ancora irrisolte molte delle questioni che riguardano la nosologia e gli indici prognostici, come ad esempio le implicazioni che tali difetti hanno nello sviluppo cognitivo, comportamentale e neuro-oftalmologico, il tasso di mortalità e l’aspettativa di vita. Negli ultimi anni sono stati identificati diversi geni correlati a forme mendeliane di CBCD, come la Sindrome di Joubert (“Joubert Syndrome”, JS) e l’Ipoplasia Ponto-Cerebellare (“Ponto-Cerebellar Hypoplasia”, PCH). Ad eccezione di queste forme, caratterizzate da una modalità di trasmissione autosomica recessiva o X-linked, la maggior parte delle malformazioni congenite del cervelletto e del tronco encefalico è sporadica, suggerendo che i meccanismi patogenetici più comuni siano rappresentati da mutazioni de novo o da riarrangiamenti genomici. In linea con questa ipotesi, riarrangiamenti cromosomici come traslocazioni, delezioni e duplicazioni sono stati implicati nella patogenesi di alcune forme sporadiche di CBCD, come la Sindrome di Dandy-Walker (“Dandy-Walker Syndrome”, DWS) (Grinberg et al., 2004). Nonostante ciò, i determinanti genetici della maggior parte di questi difetti risultano ancora sconosciuti ed attualmente i test genetici disponibili riguardano soltanto pochi CBCD, rendendo molto difficile la consulenza genetica per le coppie a rischio. Obiettivo del progetto di dottorato è stato quello di contribuire a tali conoscenze attraverso lo studio delle basi genetiche dei CBCD a trasmissione mendeliana mediante analisi molecolare di geni noti e identificazione di nuovi geni attraverso tecnologie di “Next Generation Sequencing” (NGS). Sono state utilizzate varie piattaforme NGS (tra cui Miseq e HiSeq Illumina e SOLID 5500_XL Life Technologies), e protocolli di Target Resequencing e di Whole Exome Sequencing (WES). Gli studi molecolari, bioinformatici e statistici sui dati ottenuti dall’analisi NGShanno avuto come obiettivo sia l’individuazione di nuove mutazioni patogenetiche in geni noti e di nuovi geni-malattia, aumentando in modo significativo la percentuale di diagnosi; sia lo studio di varianti rare e polimorfismi che potrebbero agire come modificatori genetici responsabili della variabilità fenotipica di questi disturbi. Questo ha permesso di ampliare le correlazioni genotipo-fenotipo,consedntendo di migliorare la diagnostica di queste condizioni al fine di offrire alle famiglie un migliore counselling e la possibilità di effettuare una diagnosi prenatale precoce.

STUDIO GENETICO MOLECOLARE DELLE SINDROMI MALFORMARIVE DEL CERVELLETTO E DEL TRONCOENCEFALO MEDIANTE UTILIZZO DI TECNICHE DI “NEXT GENERATION SEQUENCING”

MICALIZZI, ALESSIA
2017-12-18

Abstract

I difetti congeniti del cervelletto e del tronco encefalo (“Cerebellar and Brainstem Congenital Defects” - CBCD) sono patologie eterogenee caratterizzate da un’elevata variabilità fenotipica. In associazione ai segni tipici del coinvolgimento cerebellare, quali ipotonia atassia e nistagmo, i pazienti con CBCD spesso presentano ritardo mentale, alterazioni del comportamento (come autismo e tratti autistici) e variabile coinvolgimento multiorgano (Barkovich et al., 2009; Doherty et al, 2013). L’incidenza delle varie forme di CBCD può essere stimata in circa 1 su 3000/4000 nati. Nella maggior parte dei casi la diagnosi può essere effettuata anche in epoca prenatale, mediante ecografia a partire dal secondo trimestre di gestazione, e la rilevazione di tali difetti rappresenta una delle più comuni cause di interruzione volontaria di gravidanza. Sono ancora irrisolte molte delle questioni che riguardano la nosologia e gli indici prognostici, come ad esempio le implicazioni che tali difetti hanno nello sviluppo cognitivo, comportamentale e neuro-oftalmologico, il tasso di mortalità e l’aspettativa di vita. Negli ultimi anni sono stati identificati diversi geni correlati a forme mendeliane di CBCD, come la Sindrome di Joubert (“Joubert Syndrome”, JS) e l’Ipoplasia Ponto-Cerebellare (“Ponto-Cerebellar Hypoplasia”, PCH). Ad eccezione di queste forme, caratterizzate da una modalità di trasmissione autosomica recessiva o X-linked, la maggior parte delle malformazioni congenite del cervelletto e del tronco encefalico è sporadica, suggerendo che i meccanismi patogenetici più comuni siano rappresentati da mutazioni de novo o da riarrangiamenti genomici. In linea con questa ipotesi, riarrangiamenti cromosomici come traslocazioni, delezioni e duplicazioni sono stati implicati nella patogenesi di alcune forme sporadiche di CBCD, come la Sindrome di Dandy-Walker (“Dandy-Walker Syndrome”, DWS) (Grinberg et al., 2004). Nonostante ciò, i determinanti genetici della maggior parte di questi difetti risultano ancora sconosciuti ed attualmente i test genetici disponibili riguardano soltanto pochi CBCD, rendendo molto difficile la consulenza genetica per le coppie a rischio. Obiettivo del progetto di dottorato è stato quello di contribuire a tali conoscenze attraverso lo studio delle basi genetiche dei CBCD a trasmissione mendeliana mediante analisi molecolare di geni noti e identificazione di nuovi geni attraverso tecnologie di “Next Generation Sequencing” (NGS). Sono state utilizzate varie piattaforme NGS (tra cui Miseq e HiSeq Illumina e SOLID 5500_XL Life Technologies), e protocolli di Target Resequencing e di Whole Exome Sequencing (WES). Gli studi molecolari, bioinformatici e statistici sui dati ottenuti dall’analisi NGShanno avuto come obiettivo sia l’individuazione di nuove mutazioni patogenetiche in geni noti e di nuovi geni-malattia, aumentando in modo significativo la percentuale di diagnosi; sia lo studio di varianti rare e polimorfismi che potrebbero agire come modificatori genetici responsabili della variabilità fenotipica di questi disturbi. Questo ha permesso di ampliare le correlazioni genotipo-fenotipo,consedntendo di migliorare la diagnostica di queste condizioni al fine di offrire alle famiglie un migliore counselling e la possibilità di effettuare una diagnosi prenatale precoce.
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