La spettroscopia Raman come strumento di monitoraggio diagnostico e terapeutico nella leishmaniosi canina

La leishmaniosi è una zoonosi ad eziologia parassitaria che richiama una forte attenzione da parte della comunità scientifica. L’ampia diffusione dell’insetto vettore e la capacità di Leishmania infantum di provocare gravi compromissioni organiche fino ad arrivare, nei casi più gravi, al decesso dell’animale, rendono la leishmaniosi una patologia temibile. Poter disporre di una tecnica diagnostica di facile e rapida esecuzione, economica e non invasiva, rappresenterebbe una svolta positiva per la gestione della parassitosi, soprattutto se applicabile nelle prime fasi dell’infezione, quando le altre metodiche sono poco sensibili. La spettroscopia Raman è una tecnica rapida quali-quantitativa che consente la determinazione simultanea di più componenti nei fluidi biologici, attraverso la realizzazione di spettri vibrazionali, in grado di fornire informazioni sulle molecole in esame. In questo studio sono stati arruolati 140 cani che vivono in area endemica per leishmaniosi (Sicilia, Italia meridionale). Tutti gli animali sono stati sottoposti ad esame clinico completo, test sierologico per leishmaniosi (IFAT), test rapido ELISA per le principali malattie da vettore e ricerca diretta di eventuali piroplasmi o microfilarie, oltre a spettroscopia Raman su campione di siero. La ricerca si articolava in cinque fasi: 1) Fase I: valutazione degli spettri Raman sierici di cani certamente esenti da leishmaniosi e di cani con malattia conclamata, al fine di individuare delle bande d’interesse e definire un punto di cut-off capace di discernere con accuratezza i soggetti negativi da quelli positivi; 2) Fase II: valutazione degli spettri di animali sieropositivi a basso titolo (1:320; GSP) e confronto con il cut-off determinato nella Fase I, al fine di individuare gli animali eventualmente malati; 3) Fase III: valutazione degli spettri di cani esposti all’infezione e loro modificazione nel tempo, al fine di individuare precocemente gli animali con maggiori probabilità di ammalarsi; 4) Fase IV: valutazione degli spettri di cani leishmaniotici in trattamento con allopurinolo/antimoniato, al fine di verificarne l’efficacia; 5) Fase V: valutazione degli spettri di cani leishmaniotici durante il follow up post-trattamento, al fine di individuare precocemente eventuali recidive. Nella Fase I sono stati arruolati 116 cani, di cui 51 affetti da leishmaniosi conclamata (GL), mai trattati in precedenza, e 65 sani di controllo (GS). L’analisi degli spettri ha evidenziato un significativo aumento dell'intensità spettrale delle bande 1.209-1.400 cm-1 e 1.600-1.697 cm-1, corrispondenti rispettivamente alle regioni delle amidi III e I, di cui è stata calcolata l’area sotto la curva (A1 e A2, rispettivamente) e il loro rapporto (A1/A2). In tali aree d’interesse si assegnano rispettivamente gli anticorpi IgG1 e IgG2. Per valutare il grado di accuratezza del test, è stata calcolata la curva ROC e successivamente l’indice di Youden (J index). L’analisi statistica basata sul rapporto A1/A2 ha dimostrato un’eccellente accuratezza del test (AUC=0,857) con un cut-off pari a J=6,9, valore al di sopra del quale gli animali sono da considerare malati. Nella Fase II sono stati arruolati 20 cani positivi all’IFAT a basso titolo (1:320). Dall’analisi dei dati Raman, si è osservato che 4 cani presentavano un rapporto nettamente superiore al cut-off (A1/A2=7,9-11,0), individuati pertanto come malati, mentre in 8 cani era inferiore (0,77-5,90); 8 cani, invece, avevano un rapporto considerato borderline (6,33-7,11). Nella Fase III sono stati valutati nell’arco di 8 settimane 21 cani appartenenti ai gruppi precedenti (n=2 a GL; n=10 a GS; N=9 a GSP). L’analisi dei rapporti A1/A2 ha evidenziato che un cane sano, inizialmente sieronegativo, ha presentato un notevole aumento del rapporto, che si accompagnava a sieroconversione (titolo 1:80). Due cani sieropositivi a basso titolo hanno mostrato una tendenza all’aumento del rapporto, parallelamente all’aumentare del titolo anticorpale, mentre altri 2 cani si sono mantenuti alti nel tempo; i restanti 5 cani sono rimasti o sono scesi sotto il cut-off. I due cani malati e non trattati presentavano un rapporto sempre superiore al limite. Nella Fase IV sono stati inclusi 11 cani in terapia, appartenenti ai gruppi precedenti (n=8 a GL; N=3 a GSP). Dall’analisi dei dati Raman, si è osservato che la maggior parte dei cani (9/11) mostrava un netto miglioramento del rapporto A1/A2, che scendeva sotto il cut-off durante la terapia, anche in seconda settimana. Nei rimanenti 2 casi, il valore del rapporto, pur migliorando, rimaneva sopra la soglia, rispettivamente dopo 2 e 8 settimane di terapia. Entrambi i soggetti presentavano un titolo IFAT iniziale elevato (1:1.280). Nella Fase V sono stati inclusi 13 cani (4 dei quali come nuovi casi) già trattati da almeno quattro mesi. Dall’analisi dei dati Raman si è constatato che in 5 cani il valore del rapporto A1/A2 era sensibilmente più elevato del cut-off (7,55), facendo ipotizzare uno scarso controllo della malattia. In conclusione, la spettroscopia Raman si è rivelata una tecnica versatile, di semplice e rapida esecuzione, riproducibile e non invasiva, che, potrebbe essere utilizzata in corso di leishmaniosi canina come strumento di diagnosi precoce, utile anche in ambito prognostico e nel monitoraggio terapeutico, sebbene siano necessarie ulteriori ricerche per convalidare gli incoraggianti risultati osservati in questo studio.